細胞遺傳學毒性檢測主要是在分子水平檢測毒性物質對細胞遺傳性的影響；在遺傳性疾病的分子診斷和致病機制研究中，已得到廣泛應用。常用的檢測技術包括染色體畸變分析、微核試驗、基因突變和DNA斷裂檢測等。

*節染色體標本制備

    染色體是在顯微鏡下可見的細胞有絲分裂過程中出現的結構。對染色體檢查分析之前，需要進行染色體標本制備。通常情況下，都是利用外周血淋巴細胞進行染色體核型分析。正常情況下．人體外周血淋巴細胞不再分裂，但植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)可刺激血中的淋巴細胞轉化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力。因此，可采取少量外周靜血，做短期培養，刺激增殖后進入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞，經低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進行核型分析。上述制備的染色體標本經胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋條帶，表明每條染色體的特征。

一、材料與方法

(一)實驗材料

1．受試材料人外周血。

2．淋巴細胞分層液 比重為1．077±O．OOl。如Ficoll Hypaque分層液、Percoll—Paque分層液。

3．RPMll640培養液，含20％小牛血清。

4．促細胞分裂劑植物血凝素(PHA)。

5．秋水仙堿(20μg／m1)。

6．75 mmol／LMgCl2。

7．固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)。

8．Macllvaine’s緩沖液(pH 6．0)。

9．奎吖因(QM)染液(50μg／ml)。

10．O.85％生理鹽水。

11．0．25％胰酶(pH7．2)。

12．Glemsa染液。

13．O．2mol／LHCl。

14．5％Ba(OH)2 。

15．2×SSc．

16．磷酸緩沖液(pH 7．2)。

(二)實驗方法

1．人外周血淋巴細胞培養

(1)根據需要收集全血，加入肝素溶液(O．2ml肝素／10ml全血)抗凝。

(2)用PBS液將抗凝血稀釋一倍，輕輕混勻。

(3)將淋巴細胞分層液加于離心管底部，小心操作，盡量避免碰到管壁。

(4)再用毛細管將稀釋的血液沿管壁輕輕加到分層液上面，小心操作，不要將血液沖人分層液中。

(5)20OOr／min離心20min。離心后輕輕取出離心管，不要破壞分層(圖5—2)。可見從上至下分成4層：*層為稀釋的血漿；第二層為白膜層，主要含淋巴細胞，還混有少量血小板；第三層為分層液；第四層為粒細胞和紅細胞層，紅細胞沉于管底，粒細胞是緊貼在紅細胞層上面的一層薄薄的白膜。

(6)用注射器或吸管沿試管壁吸出中間的白膜層(吸時用鈍圓針頭或吸管，而不要用尖的頭吸)，加入到另外的離心管中。

(7)用5倍以上體積的PBS液洗細胞，1500r／min離心10min，快速吸出上清液。

(8)再用PBS液洗滌2次，zui后一次洗滌后，細胞沉淀重懸于5ml培養液中，細胞計數。

(9)用RPMll640培養液將細胞配成所需密度，轉移至培養瓶中加促細胞分裂劑。

(10)終止培養前2～3h，加入濃度為20 μg／ml的秋水仙素，終濃度為O．1μg／ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續培養2～3h，以積累較多停止在分裂中期的細胞。

2．制片

(1)收獲細胞：取出培養瓶，將培養液搖勻后傾入10ml刻度離心管中，1000 r／min離心8～10rnin，吸棄上清液，保留細胞懸液約O．5ml。

(2)低滲處理：向離心管中加入6ml已溫浴達37℃75mmol／L的KCl溶液，用吸管混勻，置37℃恒溫水浴箱中低滲25～30min(的低滲時間可自行摸索)。

(3)預固定：低滲處理完成后，加入1ml新配制的固定液并用吸管混勻，1000 r／min離心8～10min。吸棄上清液。

(4)固定：加入8ml固定液，用吸管將沉淀的細胞輕輕混合成細胞懸液，室溫下靜置如min后，1000 r／min離心8～10min。吸棄上清液。

(5)再固定：加入8m1固定液，用吸管輕輕吹打使細胞混勻，室溫下靜止15min或更長時間。(若不立即制片，可將離心管口蓋好，置冰箱中或更長時間)。

(6)制片：將上述細胞混懸液1000 r／min離心8～10min，吸棄上清液，視離心管中沉淀(細胞)的多少加入O．2～O．4ml左右的固定液，用吸管輕輕混成細胞懸液(混合后的液體呈淡乳白色即表示細胞濃度適當)。用吸管吸取細胞懸液盡量高距離地的滴于清潔預冷的玻片上，每片滴1～2滴，靜置并在空氣中晾干，也可在酒精燈火焰上略加烘烤。

(7)在玻片制成的一周內進行染色體顯帶。

3．染色體顯帶一QM熒光染色法

(1)常規制備染色體標本，要求背景清晰無核質覆蓋。

(2)浸入pH6．o的Macllvaine’s緩沖液內幾秒鐘。

(3)標本放入50μg／ml QM溶液中，染色20min

(4)用Macllvalne’s緩沖液(或蒸餾水)沖洗3次，每次2min。

(5)滴數滴緩沖液于標本上，覆蓋以大蓋玻片。

(6)置熒光顯微鏡下觀察。

4．染色體顯帶G顯帶染色法

(1)常規制作染色體標本，置37℃恒溫箱內72h。于實驗前6h置60℃烘箱中預處理6h。

(2)將O．85％生理鹽水50ml置37℃水浴鍋內預溫至(37±O．5)℃；將O．25％胰酶溶液用O．85％生理鹽水稀釋，終濃度為O．05％，預溫至(37±O．5)℃。

(3)將玻片投入胰酶溶液中不停擺動1 5～17s。

(4)取出玻片，立即用l：10 Giemsa染液(pH7．2磷酸緩沖液配制)染色lO～20min。

(5)自來水輕輕沖洗，空氣晾干，鏡檢。

5．染色體顯帶c顯帶染色法

(1)按常規法制備染色體標本，片齡不超過3d。

(2)用O．2 mol／L HCl溶液在室溫下處理15～30 min，以除去組蛋白和非組蛋白。

(3)自來水沖洗后，再用蒸餾水沖洗數秒。

(4)將標本浸于預溫到55～65℃5％Ba(0H)2水溶液中15～20min。

(5)立即用自來水沖洗．去掉污垢，再用蒸餾水沖洗片刻。

(6)將標本置于預溫的55℃2×SS(：溶液中55℃處理l～1．5h。

(7)用蒸餾水沖洗數秒。

(8)用l：10 Giemsa染液染色20～30min。

(9)自來水沖洗，空氣干燥，鏡檢。

二、結果分析

根據染色體的形態、大小及著絲粒的位置，將染色體分為七組。

A組染色體：包括1～3號染色體。長度zui長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。

B組染色體：包括4～5號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。

c組染色體：包括6～12號和x染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。

D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著絲粒和隨體。

E組染色體：包括16～18號染色體，16號染色體著絲粒在3／8處，17號和18號染色體著絲粒約在1／4處。

F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。

G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中zui小的，為近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。

三、注意事項

(一)接種的血樣要新鮮，如不立即培養，應放在4～25℃，于24h內培養。

(二)培養箱溫度以(37±O．5℃)為宜。

(三)培養過程中如發現血樣凝集，可將培養瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，然后繼續培養。

(四)離心速度過快，細胞團不易打散，速度過低，則使分裂象細胞大量丟失。

(五)玻片要嚴格清潔，使細胞均勻鋪開。